Тест-система для выявления генома вируса чумы мелких жвачных методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени ("Чума мелких жвачных ПЦР РВ скрининг-тест")

ФГУ ВНИИЗЖ, Россия

Общие сведения:

Тест-система "Чума мелких жвачных ПЦР РВ скрининг-тест" рассчитана на проведение 50 анализов (включая контроли).
В состав тест-системы входят следующие компоненты:
№1 реакционная смесь, объем 0,450 см3 - 2 пробирки;
№2 фермент Taq ДНК-полимераза, объем 0,014 см3 - 1 пробирка;
№3 фермент обратная транскиптаза, объемом 0,010 см3 - 1 пробирка;
№4 отрицательный контроль, объем 0,100 см3 - 1 пробирка;
№5 положительный контроль, объем 0,150 см3 - 1 пробирка.
Тест-система не содержит реагентов для выделения РНК.

По внешнему виду компоненты тест-системы представляют собой прозрачную бесцветную жидкость.
Компоненты тест-системы расфасованы в пластиковые пробирки, соответствующего объема, с завинчивающимися крышками.
На пробирки с компонентами наклеена этикетка с указанием: краткого наименования организации-производителя, наименования компонента и его номера, объема компонента, номера серии, даты изготовления (мес, год) и срока годности (мес, год).
Тест-системы, упакованные в полиэтиленовые пакеты с замком или в пачки/коробки помещают в ящики из гофрированного картона (транспортная упаковка), которые при соблюдении условий транспортирования и хранения должны обеспечить сохранность тест-системы.
Компоновка тест-системы допускает возможность дробного использования компонентов для проведения исследований по мере поступления биологического материала.

Срок годности тест-системы 12 месяцев от даты изготовления. Запрещено использовать тест-систему по истечении срока годности.
Хранение тест-системы осуществляется в темном месте при температуре от -18С до -20С.
При нарушении целостности и укупорки пробирок, изменении цвета компонентов, наличии посторонних примесей, отсутствии этикеток, а также в случае истечения срока годности, компоненты тест-системы выбраковывают и обеззараживают кипячением в течение 15 минут с последующим уничтожением.

Принцип реакции:

Процесс обнаружения генома вируса чумы мелких жвачных методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с обратной транскрипцией включает выделение РНК возбудителя из биологического материала и проведение обратной транскрипции выделенного генома с последующей амплификацией полученной ДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени.
Особенность полимеразной цепной реакции (ПЦР РВ) - возможность регистрации результата ПЦР в процессе реакции, в каждый момент времени. Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени используют ДНК-зонд, помеченный флуоресцентным красителем FAM, который комплементарен специфическому участку генома вируса чумы мелких жвачных. К зонду также присоединен гаситель флуоресценции. В ходе ПЦР происходит разрушение зонда, разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к появлению свечения. Амплификатор соответствующей марки регистрирует интенсивность свечения, в результате чего исследователь может узнать о результатах реакции без необходимости проведения электрофореза.

Порядок применения:

Тест-система предназначена для выявления генома вируса чумы мелких жвачных в образцах выделенной из биологического материала РНК (соскобы кожи, сыворотка, цельная кровь, носовые смывы, молоко и др.) методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Транспортирование и хранение биоматериала для исследования.

Материалы должны доставляться в лабораторию в течение 24 часов, при температуре от 2С и до 8С. Допускается хранение материала при температуре от -16С до -20С в течение 7 дней, при температуре от -68С до -72С в течение длительного времени.
Выделение РНК из биоматериала проводят любим доступным методом.
Для сохранения нативной РНК не рекомендуется многократное замораживание-оттаивание тестируемого материала.

Постановка полимеразной цепной реакции

Для проведения исследования на требуемое количество образцов (в т.ч. на образцы положительного и отрицательного контролей) в отдельной пробирке объединяют готовую ПЦР-смесь (пробирка №1), фермент Taq-ДНК-полимеразу (пробирка №2) и фермент обратную транскриптазу (пробирка №3). Реактивы вносят в количестве и последовательности, согласно таблице 1. Во время составления смеси ферменты следует держать на льду или на охлаждающей подставке.

Таблица 1. Состав и порядок сбора смеси для проведения реакции

Этап	Реактив	Номер пробирки	Количество на 1 пробу (мкл)	Количество на n проб
1	Реакционная смесь	№1	17	17 х (n+1)
2	Фермент Taq ДНК-полимераза	№2	0,25	0,25 х (n+1)
2	Фермент обратная транскиптаза	№3	0,125	0,125 х (n+1)

Смесь перемешивают на шейкере в течение 5-7 секунд, после чего центрифугируют в течение 3-5 секунд при 1000 об/мин. и раскапывают по 0,017 см3 в стерильные пробирки. Затем, в эти же пробирки добавляют по 0,008 см3 предварительно выделенной РНК: соответствующих анализируемых образцов, отрицательных контрольных образцов (отрицательный контроль выделения и отрицательный контроль ПЦР (пробирка №4), поставляемый с тест-системой), а также положительных контрольных образцов (положительный контроль выделения (если имеется) и положительный контроль ПЦР (пробирка №5), поставляемый с тест-системой). Пробирки закрывают и помещают в амплификатор для проведения ПЦР-РВ с возможностью детекции сигнала красителя FAM.
Программирование амплификатора осуществляется согласно инструкции производителя амплификатора. Режим термического профиля должен соответствовать показателям, описанным в таблице 2.

Таблица 2. Режим термического профиля

Этап	Температура, С	Время, сек.	Измерение флуресценции	Количество циклов амплификации
Удержание температуры	50	900	-	1
Удержание температуры	95	300	-	1
Амплификация со считыванием	94	10	-	40
Амплификация со считыванием	56	20	FAM	40
Амплификация со считыванием	72	20	-	40

Учёт и интерпретация результатов:

Результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что соответствует наличию или отсутствию на канале FAM значения порогового цикла амплификации (Ct) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой амплификатором.
Если реакция проводится на приборе Rotor-Gene, то после окончания реакции:
1. Нажмите в меню кнопку "Analysis"/"Анализ", выберете режим анализа "Quantitation"/"Количественный", затем выбрав "Cycling A. Yellow", нажмите кнопку "Show"/"Показать".
2. Отмените автоматический выбор Threshold/Порог.
3. В меню основного окна Quantitation analysis/Количественный анализ активируйте кнопки "Dynamic tube"/"Динамич. фон" и "Slope Correct"/"Коррек. уклона".
4. После выбора линейной шкалы графического изображения результатов, выберете кнопку Linear scale/Линейная шкала (в нижней части окна справа).
5. В меню окна "More settings"/"Outlier Removal"/"Устранение выбросов" установите значение NTC threshold/Порог Фона (NTC) - 10%.
6. В меню "СТ Calculation"/"Вычисление СТ" выставите Threshold/Порог = 0,1 (В правой части экрана).
7. В таблице результатов (окно "Quant. Results"/"Количественные Результаты") появятся значения Ct.
В случае использования приборов других марок, следуйте инструкции по их эксплуатации, предоставленной производителем.
Если регистрируемое значение Ct меньше/равно 35, результат обнаружения генома чумы мелких жвачных считается положительным.
Если значение Ct не регистрируется, результат обнаружения генома чумы мелких жвачных считается отрицательным.
Если регистрируемое значение Ct находится в пределах от 36 до 40, результат обнаружения генома вируса чумы мелких жвачных считается сомнительным, и подлежит повторному исследованию. Если при проведении повторного исследования регистрируемое значение Ct меньше/равно 40, результат обнаружения генома вируса чумы мелких жвачных считается положительным; если значение Ct не регистрируется, результат обнаружения генома вируса чумы мелких жвачных считается отрицательным.
Результат считается достоверным только в случае, если:
- для положительного контроля ПЦР (пробирка №5), поставляемого с тест-системой, амплификатором на канале FAM регистрирует значение порогового цикла амплификации - Ct меньше/равно 35;
- для отрицательного контроля ПЦР (пробирка №4), поставляемого с тест-системой, амплификатором не регистрирует какого-либо значений порогового цикла на канале FAM.
Результат считается недостоверным (не подлежит учету) в случае, если:
- для образца положительного контроля ПЦР (пробирка №5), поставляемого с тест-системой, регистрируется значение Ct больше 35;
- для образца отрицательного контроля ПЦР (пробирка №4), поставляемого с тест-системой, регистрируется какое0либо значение Ct.

Для получения более подробной информации о препарате, позвоните по одному из телефонов:

8 (495) 150-08-74.

Весь перечень и инструкции ветпрепаратов можно посмотреть в каталоге продукции на нашем сайте. В отношении цены, а также о возможности покупки Вас с удовольствием проинформируют наши менеджеры.

<< Назад в раздел

Понравился сайт? Поделись с друзьями!